Нанобиотехнологии в России: диагностика социально значимых заболеваний

Наноколонии (молекулярные колонии) образуются, когда матричные биологические наномолекулы (ДНК или РНК) размножают при помощи матрицазависимых ферментов-полимераз в иммобилизованной водной среде например, в геле, полимерный матрикс которого образует трехмерную сеть с размером пор в нанометровом диапазоне. Матрикс предотвращает конвекцию жидкости и препятствует диффузии наномолекул. В результате, потомство каждой исходной наномолекулы не распространяется по реакционному объему, а концентрируется вокруг родительской молекулы. При использовании тонкого слоя геля наноколонии располагаются в одной фокальной плоскости, что облегчает их наблюдение.

Число молекул в наноколонии определяется эффективностью ферментной системы размножения и временем реакции (числом циклов размножения), а размер колонии и плотность упаковки в ней наномолекул размером размножаемых молекул и плотностью (размером пор) геля. Регулируя эти параметры, всегда можно размножить отдельную матричную наномолекулу до количества, детектируемого используемым регистрирующим устройством. Мелкие наноколонии позволяют разрешать огромное число матричных наномолекул на небольшой площади геля, но для их обнаружения надо использовать микроскоп. Крупные наноколонии, содержащие до 108 копий родительской молекулы, можно увидеть без увеличения (рис. 1, 2). Так как практически каждая наноколония происходит из одной матричной молекулы, с помощью наноколоний можно обнаруживать, подсчитывать и идентифицировать одиночные молекулы ДНК или РНК, в т.ч. с диагностическими целями.

Применение наноколоний делает диагностику цифровым методом, поскольку для обнаружения молекулымишени достаточно просто зарегистрировать сигнал от колонии, не измеряя его величину. Это существенно повышает надежность и точность диагностики. Кроме того, разделение в пространстве размножаемых наномолекул практически исключает конкуренцию со стороны посторонних (отличных от мишени) матриц. Содержание таких матриц в клинических образцах очень высоко, и их неспецифическое размножение ограничивает чувствительность используемых в настоящее время методов молекулярной диагностики, основанных на размножении ДНК или РНК в жидкости, до 100-1000 молекул мишени. Использование же наноколоний позволяет обнаружить одну молекулу ДНК-мишени или две молекулы РНК-мишени на фоне даже триллионкратного избытка посторонних ДНК и РНК.

РИСУНОК 1 | Наноколонии, формирующиеся в полиакриламидном геле при размножении с помощью ПЦР одиночных химерных молекул AML1-ETO, являющихся маркерами одного из видов лейкоза (рака крови). Растущие бесцветные наноколонии химерных молекул ДНК становятся видимыми благодаря гибридизации с присутствующими в геле олигонуклеотидами, меченными флуоресцентными группами, между которыми возможен резонансный перенос энергии (FRET). Гель облучают синим светом, поглощаемым группой-донором, а детектируют красный свет, излучаемый группой-акцептором. Красное свечение возможно, только если донор

Наноколонии изобретены в Институте белка РАН [3, 4] и успешно применяются в нашей стране и за рубежом для решения различных научных и прикладных задач. Данный проект посвящен применению наноколоний для диагностики рака.

В России от разных видов рака умирает около 300 000 человек в год, что представляет собой большую демографическую, экономическую и социальную проблему. Лечение осложняется тем, что у большинства больных болезнь диагностируется уже на поздних стадиях. С развитием экономики проблема может только усугубляться, так как частота онкологических заболеваний растет по мере ухудшения экологической обстановки и увеличения продолжительности жизни населения. Эффективность лечения рака зависит от своевременности диагностики. Однако до сих пор проблема ранней диагностики рака не решена.

Проект направлен на создание технологии молекулярной диагностики рака на стадии, когда его еще невозможно обнаружить существующими методами. Диагностировать болезнь предполагается путем обнаружения в клинических образцах (например, в крови, моче или в мокроте) молекул определенных индикаторных (маркерных) РНК, которые присутствуют во всех раковых клетках независимо от вида рака. Примером такого универсального маркера является матричная РНК белковой субъединицы теломеразы фермента, отвечающего за синтез концевых участков хромосом (теломер). Эта мРНК присутствует и в нормальных стволовых клетках, которые, подобно раковым клеткам, способны к неограниченному делению. Однако, в отличие от раковых клеток, стволовые клетки находятся в своих нишах и не распространяются по организму. Поэтому присутствие теломеразной мРНК там, где стволовых клеток быть не должно (например, в плазме или клетках крови) может служить указанием на наличие злокачественного процесса. Существуют также РНК, которые могут служить групповыми маркерами, например, маркерами всех видов рака кишечника, или всех видов рака молочной железы, или всех видов рака печени. Попытки использовать РНК-маркеры для молекулярной диагностики рака были и раньше, но из-за ограниченной чувствительности и недостаточной специфичности стандартной ПЦР (полимеразной цепной реакции) они закончились неудачей.

РИСУНОК 2 | Процесс анализа изображения наноколоний, полученного с помощью флуоресцентного сканера микрочипов

Цель проекта, работа над которым завершается в конце текущего года, составить перечень РНК-маркеров, рекомендуемых для широкомасштабных клинических исследований, а также создать лабораторный прототип диагностического набора (Государственный контракт 02.512.11.2098 от 9 апреля 2007 г.). В качестве основного исследуемого материала используется кровь, забор которой является одной из наиболее простых и наименее опасных для здоровья человека клинических процедур. Выявленных больных можно будет затем подвергать лечению и/или более детальному обследованию с целью идентификации и точной локализации опухоли. В перспективе создаваемый способ может стать основным методом первичного массового обследования (скрининга) всего населения или его части, например, определенных возрастных или профессиональных групп с повышенным риском онкологических заболеваний.

Следует отметить исключительно высокий потенциал наноколоний для диагностики любых заболеваний, для которых существуют РНК-или ДНК-маркеры, в т.ч. инфекционных и генетических, а также для мониторинга окружающей среды, решения задач судебной медицины, обнаружения следовых количеств генетически модифицированных организмов. Более того, наноколонии могут быть использованы для детекции молекул, отличных от ДНК или РНК. Например, молекула белка (в том числе, белка-маркера рака) может быть обнаружена путем размножения суррогатной ДНК-мишени, образованной лигированием фрагментов ДНК, способных одновременно связаться с данной молекулой белка посредством специфических лигандов (например, антител). Подобным же образом с помощью наноколоний можно обнаружить одиночные молекулы любого вещества (например, наркотика или допинга), достаточно сложные для формирования на своей поверхности, по крайней мере, двух участков специфического связывания лигандов.